CRISPR/Cas9 para reparar o xene RDEB

A metade do proxecto, os investigadores informan que acadaron con éxito a metade dos seus fitos. Os seus "parches" xenéticos están funcionando de forma máis eficiente do esperado, pero son máis pequenos. Isto significa que necesitarán máis deles e centraranse nisto durante a segunda metade do proxecto.

Investigador principal: O doutor Sergio López-Manzaneda é investigador do CIEMAT cunha sólida formación en edición do xenoma.

Co-investigadores: O doutor Fernando Larcher é profesor asociado de Bioquímica da Universidade Carlos III de Madrid e Xefe de División do CIEMAT (División de Biomedicina Epitelial).

Alex Bassons Bascuñana é doutorando no Grupo de Biomedicina Epitelial da Unidade de Innovación Biomédica do CIEMAT.

Colaboración: A doutora Paula Rio é unha experta recoñecida internacionalmente en edición xénica e terapia xénica de enfermidades hematopoyéticas hereditarias, desde a ciencia básica ata os ensaios clínicos.

"Este enfoque de edición de xenes non víricos busca unha estratexia universal e de baixo custo para xerar unha biblioteca de ferramentas capaces de abordar todas as mutacións coñecidas... En futuros estudos preclínicos, utilizaranse queratinocitos e fibroblastos editados con "parche" xenético dos pacientes. para xerar equivalentes de pel de bioenxeñería".

– Dr Sergio López-Manzaneda

Título da subvención: parche de edición de xenoma non viral de COL7A1.

Neste proxecto, propoñemos unha estratexia de edición do xenoma centrada no tratamento non só dunha mutación puntual senón de grupos de mutacións veciñas que causan RDEB, reparando os exóns completos que os albergan. Este "parche xenético" baséase no mecanismo natural de reparación do ADN de recombinación homóloga (HR) facilitado polo sistema CRISPR/Cas9. Os "parches" representan pequenos (300-400 pares de bases) modelos de ADN doador HDR de dobre cadea que se deseñarían a partir de secuencias xenéticas suficientes para cubrir poucos exóns contiguos, neste caso, correspondentes ao xene COL7A1 que codifica coláxeno tipo VII. O noso obxectivo é caracterizar (eficacia, seguridade) e estandarizar o uso destas tecnoloxías coa idea de dispor de parches específicos dispoñibles para abordar grupos individuais de mutacións. A tecnoloxía non viral proposta para o tratamento ex vivo de células do paciente RDEB facilitará a súa traslación á clínica a baixo custo.

Un dos enfoques terapéuticos máis prometedores para a EB é a edición do xenoma mediante tecnoloxías CRISPR/Cas9. Durante os últimos 7 anos o noso laboratorio estivo traballando activamente neste campo proporcionando datos sólidos de proba de concepto co obxectivo de traducir os seus resultados á clínica. Mentres estamos ao bordo da aplicación clínica cun destes enfoques que obtivo a designación de medicamento orfo pola Axencia Europea de Medicamentos (EU/3/20/2253), seguimos buscando estratexias de edición do xenoma máis eficientes, seguras e clínicamente relevantes.

Neste proxecto propoñemos probar un enfoque innovador de edición de xenes que non require o uso de vectores virais (todo o material introdúcese mediante unha única electroporación). O obxectivo é utilizar estes "parches xenéticos" para corrixir rexións mutadas despois de cortar esta rexión xenética coa tecnoloxía CRISPR/Cas9. Deseñamos catro "parches" diferentes, é dicir, modelos de doadores de dsDNA modificados especificamente nos seus extremos por unha tecnoloxía propietaria do noso provedor (Integrated DNA technologies, IDT) para favorecer o HDR. Estes modelos conteñen dous exóns e os seus arredores (73 e 80, dous "parches" cada un) e catro puntos de corte diferentes (dous para o exón 73 e dous para o exón 80). Estes modelos (ao redor de 300-400 pb) tamén cobren os exóns veciños.

Pretendemos avaliar o alcance da reparación dentro dos "parches" que nos permitirían abordar grupos de mutacións ou, se o sistema funciona o suficientemente ben, corrixir completamente os exóns dentro dos "parches". Cremos que esta nova estratexia de edición xenética, sen viral e personalizada, podería traducirse facilmente á clínica cun custo económico significativo.

Acadamos con éxito a metade dos fitos da subvención. Inicialmente, a nosa estratexia tiña como obxectivo reescribir o xenoma usando "parches" de ADN para cubrir pares de exóns (específicamente apuntando a mutacións en pares de exóns: 72-73, 73-74, 79-80 e 80-81). Non obstante, os parches de ADN que utilizamos resultaron ser lixeiramente diferentes do que esperabamos. Estes parches poden reescribir o xenoma cunha eficiencia superior ao 80 %, que é superior á informada anteriormente, pero a súa acción limítase a unha ventá estreita. Tendo en conta isto, a nosa estratexia da fase 2 centrarase agora en parches individuais de ADN para cada exón. Para garantir que non modificamos secuencias de ADN saudables, o "corte molecular" CRISPR/Cas9 só dirixirá a secuencias mutadas. Isto requirirá pequenos ARN específicos para cada mutación, mentres que se pode usar un parche de ADN común para cada exón. (Do informe de xullo de 2024).